产γ-氨基丁酸红曲菌种的筛选及其发酵工艺条件研究

食品与发酵科技　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　第４７卷（第４期）Ｖｏ１．４７，Ｎｏ．４　产ｙ一氨基丁酸红曲菌种的筛选及其发酵　工艺条件研究　胡珊，王小波，戴甄，蓝小玲，李学如　（西南交通大学生命科学与工程学院，６１００３１成都）　摘要：从传统发酵食品中分离的２０株红曲霉中，筛选获得一株　一氨基丁酸高产菌ＭＸＬ一８，正交试验确定该菌株　发酵培养基组成为２％大米粉，２．Ｏ％蛋白胨，１．５％酵母膏，Ｏ．１５％硝酸钠，０．１５％磷酸二氢钾，Ｏ－２％硫酸镁。用上述发酵培　养基２９￣（２，２００ｒ／ｍｉｎ摇瓶发酵培养６天，ＧＡＢＡ的产量可达２２．３７３ｍｇ／ｍｌ，与目前报道相关资料比较，我们认为该菌　株具有进一步研发功能性食品的优势。　关键词：红曲霉；　一氨基丁酸；发酵工艺　中图分类号：ＴＱ９２０．６　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７４—５０６Ｘ（２０１　１）０４—００６４—０００４　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ￣，－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｍｏｎａｓｃｕｓ　Ｓｔｒａｉｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ＨＵ　ｓｈａｎ，ＷＡＮＧ　Ｘｉａｏ—ｂｏ，ＤＡＩ　Ｚｈｅｎ，ＬＡＮ　Ｘｉａｏ－ｌｉｎｇ，ＬＩ　Ｘｕｅ－ｒｕ　（Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆＬｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｅｎ垂ｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００３１）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＭＸＬ一８　ｓｒａｉｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈ—ｙｉｅｌｄｉｎｇ＾ｙ—ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ　Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｗａｓ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｆｒｏｍ　２０　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｆｏｏｄｓ．Ｔｈｅ　ｃｕｈｕｒｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ａｎｄ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＭＬ一８　ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｂｙ　ｍｅａｎｓ　０　ｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ａｎｄ　（４　）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ．．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　２％ｏｆ　ｒｉｃｅ　ｌｆｏｕｒ，２．０％ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｅｐｔｏｎｅ，１．５％ｏｆ　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，０．１　５％ｏｆ　ＮａＮＯ３，０．１　５％ｏｆ　ＫＨ２ＰＯ４，ａｎｄ　０．２％ｏｆ　ＭｇＳＯ４．Ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ＧＡＢＡ　ｗａｓ　２２．３７３ｍｇ／ｍＬ　ａｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　２９℃，ｓｈａｋｉｎｇ　ｓｐｅｅｄ　２００ｄｍｉｎ，　ａｎｄ　ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ　ｔｉｍｅ　ｆｏｒ　６　ｄａｙｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔ　ｗａｓ　ｆｅａｓｉｂｌｅ　ｔｏ　ｕｓｅ　ＭＬ－８　ｔｏ　ｐｒｅｐａｒｅ　ＧＡＢＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｔｈｅ　ｒｉｃｈ　ＧＡＢＡ　ｈｅａｌｔｈ　ｆｏＯｄｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍｏｎａｓｅｕｓ；ＧＡＢＡ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１６７４—５０６Ｘ．２０ｔ　１．０４—０１８　红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｓｐｐ．）是一类十分重要的药食　同源真菌，以大米为原料，经红曲霉发酵生产的红曲　在我国有近千年的使用历史，特别是近年来，随着对　红曲有效生理活性物质的深入研究，越来越多的药　压、降血脂、治疗精神疾病、预防老年痴呆、抗焦虑、　活化。肾功能，改善肝功能，防止肥胖等重要的生理功　能　】，在医药和食品上具有广泛的应用前景。由于天　然食品中ＧＡＢＡ含量稀少，依靠从食物中摄取的　ＧＡＢＡ远远不足需要，卫生部２００９年第ｌ２号公告　用成分被挖掘，红曲作为传统药食同源生物制品，被　广泛用于医药和食品等行业　１。＾ｙ一氨基丁酸（　一ａｍｉ　ｎｏｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ，ＧＡＢＡ），是一种天然存在的功能性　批准ＧＡＢＡ为新资源食品［６１。　本文报道从传统发酵食品中分离的２０株红曲　霉中，筛选到一株产ＧＡＢＡ较高菌株，并对菌株发酵　非蛋白质性的氨基酸，具有延缓神经细胞衰老、降血　收稿日期：２０１１－０５—２７　基金项目：中央高校基本科研业务费专项基金（ＳＷＪＴＵ０９２Ｔ２８）　作者简介：胡珊（１９８７一），硕士研究生，研究方向：微生物与生化药学。　拳通讯作者：Ｔｅｌ：＋８６—２８—８７６００９９０；Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｕｅｒｕｌｉ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ　第４７卷（蕙第１６４期）　胡珊等：产＾ｙ一氨基丁酸红曲菌种的筛选及其发酵工艺条件研究　６５　生产ＧＡＢＡ工艺进行初步研究，研究结果为下一步　研发富含ＧＡＢＡ的功能性保健食品打下基础。　１材料与方法　１．１菌种　ＭＬ一８由本实验室从传统发酵食品中分离获得。　１．２培养基　斜面培养基：８Ｂｅ麦芽汁，２％琼脂，ｐＨ自然。　种子培养基：３％大米粉，３％葡萄糖，０．２％硝酸　钠，０．１５％磷酸二氢钾，０．１％硫酸镁，ｐＨ自然。　发酵培养基：２％大米粉，２．Ｏ％蛋白胨，１．５％酵母　膏，０．１５％硝酸钠，０．１５％磷酸二氢钾，０．１％硫酸镁，　ｐＨ自然。　１．３试剂　一氨基丁酸标准品（上海缘聚生物科技有限公　司，层析纯），四硼酸钠（成都市克隆化工试剂厂，分　析纯），次氯酸钠溶液（成都市方舟化学试剂厂，分析　纯），无水乙醇（广东光华化学厂有限公司），苯酚（天　津市巴斯夫化工有限公司，分析纯）。　１．４实验仪器　ＺＨＷＹ２１　１Ｂ恒温培养摇床（上海智城分析仪器　制造有限公司）；Ｖ一１１００Ｄ可见分光光度计（上海美　谱达仪器有限公司）。　１．５实验方法　１．５．１种子的制备　挑取活化后的菌株接种于装有５０ｍＬ种子培养　基的５００ｍＬ三角瓶，２９℃、２００ｒ／ｍｉｎ摇床培养２ｄ。　１．５．２摇瓶发酵　将种子培养液按１０％的接种量接种到含有　５０ｍＬ发酵培养基的５００ｍＬ三角瓶中，２９ｏＣ、２０Ｏｒ／　ａｒｉｎ摇床培养一定时间，取出测定发酵液中ＧＡＢＡ　的含量。　１．５－３　一氨基丁酸分析方法　按文献介绍的方法进行ｐ　。　ＧＡＢＡ标准曲线的制作：取配置好的ＧＡＢＡ标　准液（１ｍ￣ｍＬ）ＯｍＬ，０．２ｍＬ，０．４ｍＬ，０．６ｍＬ，０．８ｍＬ，　１．０ｍＬ于６只比色管，然后分别加入蒸馏水补足到　ｌｍＬ，加入０．５ｍＬ的０．０１ｍｏｌ／ｍＬ四硼酸钠，１．ＯｍＬ的　６％苯酚，混匀；加入１．０ｍＬ次氯酸钠溶液，混匀后静　置５ｍｉｎ一８ｍｉｎ，沸水浴１０ｍｉｎ，立即冰浴５ｍｉｎ，加入　２．０ｍｌ的６０％乙醇，在６４０ｎｍ测量其吸光度。　发酵液中ＧＡＢＡ含量测定的方法：取一定量的　发酵液，沸水浴５ｒａｉｎ，冷却，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，　取上清ｌｍＬ于５０ｍＬ容量瓶中，定容后混匀，取　ｌｍＬ，按标准曲线测定方法测定发酵液中ＧＡＢＡ含　量。　２结果与讨论　２．１　一氨基丁酸标准曲线的制作　实验获得　一氨基丁酸标准曲线如图１所示，回　归曲线方程为：ｙ＝０．４２０１ｘ＋０．０２５３，相关系数Ｒ　为　０．９９８１，表明所得的方程符合要求，可用于发酵液中　的ＧＡＢＡ含量测定。　∈　Ｅ　一　删　＜ｍ　《　∞　《　０　０　０　０　５　１　１．５　２　２．５　ＯＤ值（６４０ｎｍ）　图１　ＧＡＢＡ标准曲线　Ｆｉｇ．１　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ＧＡＢＡ　２．２产＾ｙ一氨基丁酸菌株的筛选　对实验室保存的２０株红曲霉进行发酵培养５　天后，测定发酵液中　一氨基丁酸含量，有四株红曲　霉菌分离株产ＧＡＢＡ含量相对较高（图２所示），其　中２号分离菌株的ＧＡＢＡ产量最高，达到了４．１ｍ　ｍＬ。我们将２号菌株命名为ＭＬ一８，以ＭＬ一８为出发　菌株，进一步对该菌株产ＧＡＢＡ工艺条件进行了研　究。　．．＿Ｊ　Ｅ　Ｅ　一　删　如　《　∞　《　０　１　２　３　４　菌株　图２产ＧＡＢＡ的红曲霉菌分离株　Ｆｉｇ．２　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ＧＡＢＡ　ｏ１　Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　２．３正交实验确定分离菌株产ＧＡＢＡ的培养基组成　碳源和氮源是发酵生产　一氨基丁酸的主要影　响因素ｌ９＇　Ｏｌ，本实验通过正交实验（四因素、三水平，　（３　））研究培养基中大米粉、蛋白胨、酵母膏和硝酸　钠对红曲霉菌发酵生产ＧＡＢＡ的影响。实验结果表　１显示，酵母膏对ＧＡＢＡ产量的影响最大，极差Ｒ值　为１３．４６４，其次是大米粉，硝酸钠对ＧＡＢＡ的生产几　乎没有什么影响。正交实验序号３号配方ＧＡＢＡ产　食品与发酵科技　２０１１年第４期　量最高，达到１７．２５ｍｇ／ｍＬ。由于２．０％和２．５％蛋白胨　对ＧＡＢＡ产量影响不大，从生产成本因素考虑，选择　２．０％的蛋白胨。最终获得２号菌发酵生产ＧＡＢＡ培　养基组成为：２％大米粉，２．０％蛋白胨，１．５％酵母膏，　０．１５％硝酸钠，Ｏ．１５％磷酸二氢钾，０．１％硫酸镁。　表１　（３　）正交实验设计结果　Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　Ｌ。（３４）　２．４　ＭＬ一８菌株ＧＡＢＡ发酵工艺条件的研究　２．４．１种龄和接种量对ＧＡＢＡ发酵的影响　在其他条件不变的情况下，研究种子培养时问　和接种量对红曲霉菌发酵产ＧＡＢＡ影响。结果表明，　在种子培养基中培养４８ｈ的种子，按１０％－１５％接种　量接种到发酵培养基中发酵培养５ｄ，菌株产ＧＡＢＡ　最高达１８．０７３　ｍｇ／ｍＬ。　２．４．２不同装液量对ＧＡＢＡ产量的影响　红曲霉发酵生产ＧＡＢＡ为好氧发酵，培养基中　的溶解氧浓度是影响发酵的主要因素，摇瓶发酵装　液量与溶氧相关。不同的装液量对菌株ＧＡＢＡ的产　量影响结果图３可知，ＭＬ一８株发酵对氧的需求较　大，５００ｍＬ三角瓶装液量为５０ｍＬ和７５ｍＬ，ＧＡＢＡ　的产量最高，达１９．４７２ｍｇ／ｍＬ。随后，ＧＡＢＡ产量随着　装液量的增加而降低，装量１５０ｍＬ时ＧＡＢＡ的产量　为１１．９８６ｍｇ／ｍＬ。不同装液量对ＧＡＢＡ产量影响研　究结果提示，在今后使用２号分离菌株大规模发酵　生产ＧＡＢＡ过程中，特别要注意发酵液中溶解氧对　ＧＡＢＡ产量的影响，加大通气量将有利于ＧＡＢＡ产　量的提高。　２．４＿３发酵培养时间对ＧＡＢＡ产量的影响　在其他条件不变的情况下，研究发酵时间对分　离株发酵影响结果图４可知，发酵培养２ｄ，菌株开　始产ＧＡＢＡ，随着培养时间的增加，ＧＡＢＡ的产量也　逐渐增加，当培养６ｄ时，ＧＡＢＡ的产量达到最大　２Ｏ　一＿Ｊ　１６　０）　三１２　删　知８　《　雩　４　－ｒ－　０　ｂＵ　／ｂ　１ＵＵ　１２ｂ　１ｂＵ　培养基装量（ｍＬ／５００ｍＬ三角瓶）　图３装液量对ＧＡＢＡ产量的影响　Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｆｏ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｎ　ＧＡＢＡ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　２２．３７３ｍｇ／ｍＬ，继续培养到第７ｄ，ＧＡＢＡ产量增ＪＪｌｌ较　小，这可能是随着培养时间延长，菌种进入衰亡期，　菌种的生长和代谢产物ＧＡＢＡ形成下降，【夭Ｊ此，　ＭＸＬ一８发酵产ＧＡＢＡ的最佳培养时问为６ｄ。　２４　ｊ　２０　三１６　１２　矗８　舌　４　０　发酵时间（天）　图４培养时间对ＧＡＢＡ产量的影响　Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ＧＡＢＡ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　３总结　经红曲霉菌发酵生产的红曲在我国应用距今已　有近１　０００年的历史，作为药食同源的红曲在医药　和食品中广泛使用，长期的实践证实了红曲的安全　性。＾ｙ一氨基丁酸作为新资源食品添加剂获卫生部批　准，因此从红曲中筛选高产＾ｙ一氨基丁酸菌种，研究　发酵工艺，生产含　一氨基丁酸高的红曲，开发成功　能保健食品具有重要的应用价值。本研究筛选出的　红曲霉菌ＭＸＬ一８液态发酵产　一氨基丁酸的最高产　量为２２．３７３ｍｇ／ｍｌ，较国内目前相关报道的产量提高　很多ｌ７、９、”１，因此本实验研究成果为利用红曲发酵生　产富含ＧＡＢＡ的功能性食品奠定了基础。　参考文献　【１】张菲菲，周立平，嘉晓勤等红曲菌应用研究进展ＩＪ１酿　酒科技，２００９，７：９１—９４　［２］张晖，姚惠源，姜元荣富含＾ｙ一氨基丁酸保健食品的研　究与开发［Ｊ］食品与发酵工业，２００２，２８（９）：６９—７２．　［３］Ｇｕｉｎ　ＴＷＣ，Ｂｏｔｔｉｇｌｉｅｒｉ　ＴＳＩ．ＧＡＢＡ，－，／一ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ，　ａｎｄ　ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ　ＩＪＪ．Ａｎｎ　Ｎｅｕｒｏｌ，２００３，６：３—１２．　第４７卷（写第１６４期）　胡珊等：产　一氨基丁酸红曲菌种的筛选及其发酵工艺条件研究　６７　（上接第５１页）提取次数４次。　２．２－３验证试验　参考文献　【１】梁引库，徐仲阳．巨大型蒲公英黄酮提取工艺研究【Ｊ］．安徽　按照方案Ａ，Ｂ　Ｃ。Ｄ２Ｅ　做验证性试验，平行三次，　取平均值，得最佳工艺条件下提取总黄酮含量为　４．０１％。　农业科学，２００９，３７（３０）：１４８８１．　【２】李喜风，郝哲，杜云锋．蒲公英的生物活性研究进展［Ｊ１．中　药材，２００９，３２（５）：８２３．　【３】罗艺萍．总黄酮类化合物的药理活性研究进展【Ｊ】．亚太传　统医药，２０１０，６（４）：１２６—１２７．　『４］王慧．总黄酮类化合物生物活性的研究进展［ＪＩ．食品与药　３结论　从蒲公英中提取总黄酮的最佳工艺条件为：乙　醇体积分数６５％、料液比为１：３５、超声时间为　３５ｒａｉｎ、超声温度为６０℃、提取次数４次；影响因素的　主次关系为：乙醇体积分数＞料液比＞超声温度＞超　声时间＞提取次数；在最佳提取工艺条件下，总黄酮　含量为４．０１％。利用超声波辅助提取，极大地缩短了　品，２０１０，１２（０９）：３４７—３４９．　［５】唐涌连，彭志刚．总黄酮类化合物的抗血液肿瘤作用【ＪＪ．中　国实用医药，２０１０，５（１７）：２３６—２３７．　［６］赵菲，金永生，吴秋业．总黄酮类化合物生物活性及其构效　关系的研究进展『Ｊ］．药学服务与研究，２０１０，１０（５）：３２５—３２８．　［７］李健民，徐艳明，朱魁元等．蒲公英抗氧化生物活性研究进　展【ＪＪ．中医药学报，２０１０，３（８），１３８　提取时间。因此，该工艺具有省时、高效、节能等优　点，为实际生产提供了一定的理论依据。　（上接第５９页）反应时间为４ｈ，反应液ｐＨ为５．Ｏ。在　参考文献：　【１】陶颜娟．，ｊ、玉米皮膳食纤维的改性及应用研究．江南大学　硕士学位论文，２００８　此条件下，植酸去除率为７１．６２％。影响植酸降解的　因素大小排序为：反应液ｐＨ＞反应温度＞反应时间。　３．２去除淀粉试验中，通过单因素试验获得去除淀　粉的较优试验条件为：料液比为１：１５，蒸煮温度为　１２１ｃＩ＝，蒸煮时间为２０ｍｉｎ。　『２ｌ李丽，崔波，白伟芸．玉米胚芽蛋白的综合利用［Ｊ】．食品与　发酵科技．２０１０，４６（２）：１６—１８　【３】胡叶碧，王璋．纤维素酶和木聚糖酶对玉米皮膳食纤维组　３．３去除蛋白质试验中，通过单因素试验获得去除　玉米皮中蛋白质的较优试验条件为：中性蛋白酶酶　用量为７Ｕ／ｇ，酶解时间为４ｈ，酶解液ｐＨ为７．０，底物　浓度为ｌ：１４。　成和功能特性的影响【Ｊ］．食品工业科技，２００６，２７（１１）：　１０３—１０５　［４］张延坤．膳食纤维在食品中的应用［Ｊ】．食品工业，１９９７，（６）：　３０—３２　３．４本实验制备的玉米皮膳食纤维粉的总膳食纤　维含量可达９５．８％，其中可溶性膳食纤维含量为　３．９％　【５】　肖安红．常见膳食纤维微粉的研究．华中农业大学学位论　文，２００８，１０　【６】大连轻工业学院等八大学院．食品分析［Ｍ】．第～版．北京：　中国轻工业出版社，１９９５：１５２－２１１，２１４￣２３０，２８５～２９５